Il datore di lavoro, ai sensi dell'art. 2, comma 1, lettera b, è il soggetto titolare del rapporto di lavoro con il lavoratore o, comunque, il soggetto che, secondo il tipo e l'assetto dell'organizzazione nel cui ambito il lavoratore presta la propria attività, ha la responsabilità dell'organizzazione stessa o dell'unità produttiva in quanto esercita i poteri decisionali e di spesa. La definizione unisce un criterio formale, la titolarità del contratto, e un criterio sostanziale, l'effettivo potere di decidere e di spendere.
Nelle società di capitali, in assenza di specifica individuazione, il datore di lavoro coincide con il legale rappresentante o con l'intero consiglio di amministrazione. Nei gruppi con più stabilimenti è possibile individuare un datore di lavoro per ciascuna unità produttiva, purché il soggetto designato disponga davvero di autonomia gestionale e di budget: un direttore di stabilimento che deve chiedere alla sede l'autorizzazione per ogni spesa sopra poche migliaia di euro difficilmente sarà riconosciuto come datore di lavoro in sede giudiziaria.
Nelle pubbliche amministrazioni il datore di lavoro è il dirigente al quale spettano i poteri di gestione oppure il funzionario non dirigente preposto a un ufficio con autonomia gestionale, individuato dall'organo di vertice tenendo conto dell'ubicazione e dell'ambito funzionale degli uffici. In caso di omessa o errata individuazione, datore di lavoro resta l'organo di vertice.